Opracowanie i charakterystyka polimerowych nanocząstek z antyoksydantem

Celem niniejszej pracy było opracowanie i scharakteryzowanie polimerowych nanocząstek (NP) z glutationem (GSH) – antyoksydantem, który pełni funkcję obronną komórki przed reaktywnymi formami tlenu (RTF). W celu przygotowania NP zawierających GSH (NP-GSH) wykorzystano metodę podwójnej emulsji (W/O/W) i odparowania rozpuszczalnika organicznego. Otrzymane NP-GSH scharakteryzowano pod względem wielkości, potencjału zeta, wydajności enkapsulacji, aktywności antyoksydacyjnej oraz wyznaczono profile uwalniania GSH z NP. Stwierdzono, że średnia wielkość NP-GSH wynosi 340-385 nm, a ich ładunek powierzchniowy jest dodatni. Wydajność procesu formulacji pustych NP i NP-GSH wynosiła odpowiednio: 65,3 ± 7,1 i 66,8 ± 12,5 proc. Zawartość GSH w NP‑GSH oznaczono metodą pośrednią z różnicy początkowej ilości GSH i w supernatancie oraz metodą bezpośrednią poprzez rozpuszczenie NP-GSH w metanolu i oznaczenie zawartości GSH metodą HPLC. Wydajność enkapsulacji GSH w NP wynosiła odpowiednio: 19-36 proc. w metodzie bezpośredniej i 32-55 proc. w metodzie pośredniej.
Do określenia aktywności antyoksydacyjnej NP-GSH wykorzystano rodnik 2,2’-difenylo‑1‑pikrylhydrazylowy (DPPH°). GSH zawarty w NP reagował z DPPH° osiągając stan równowagi po 90 minutach inkubacji w 20°C w mieszaninie metanolu z buforem cytrynianowym (95:5, v/v) i wykazywał aktywność antyrodnikową. Profil uwalniania GSH z NP został wyznaczony w warunkach in vitro w pH 7,4 i jego przebieg wskazywał na bardzo szybkie uwalnianie substancji aktywnej (96 proc. uwolnienie GSH z NP po 5 minutach inkubacji w 37°C). Jednocześnie zaobserwowano bardzo wysoki stopień utlenienia GSH do disiarczku glutationu (GSSG). Poprawę profilu uwalniania GSH z NP‑GSH prawdopodobnie można uzyskać poprzez koenkapsulację GSH z innymi związkami, które przedłużałyby czas jego uwalniania z NP (np. cycklodekstryny).

STRESZCZENIE

Celem niniejszej pracy było opracowanie i scharakteryzowanie polimerowych nanocząstek (NP) z glutationem (GSH) –antyoksydantem, który pełni funkcję obronną komórki przed reaktywnymi formami tlenu (RTF).
W celu przygotowania NP zawierających GSH (NP-GSH) wykorzystano metodę podwójnej emulsji (W/O/W) i odparowania rozpuszczalnika organicznego. Otrzymane NP-GSH scharakteryzowano pod względem wielkości, potencjału zeta, wydajności enkapsulacji, aktywności antyoksydacyjnej oraz wyznaczono profile uwalniania GSH z NP. Stwierdzono, że średnia wielkość NP-GSH wynosi 340-385 nm, a ich ładunek powierzchniowy jest dodatni. Wydajność procesu formulacji pustych NP i NP-GSH wynosiła odpowiednio: 65,3 ± 7,1 i 66,8 ± 12,5 proc. Zawartość GSH w NP‑GSH oznaczono metodą pośrednią z różnicy początkowej ilości GSH i w supernatancie oraz metodą bezpośrednią poprzez rozpuszczenie NP-GSH w metanolu i oznaczenie zawartości GSH metodą HPLC. Wydajność enkapsulacji GSH w NP wynosiła odpowiednio: 19-36 proc. w metodzie bezpośredniej i 32-55 proc. w metodzie pośredniej.
Do określenia aktywności antyoksydacyjnej NP-GSH wykorzystano rodnik 2,2’-difenylo‑1‑pikrylhydrazylowy (DPPH°). GSH zawarty w NP reagował z DPPH° osiągając stan równowagi po 90 minutach inkubacji w 20°C w mieszaninie metanolu z buforem cytrynianowym (95:5, v/v) i wykazywał aktywność antyrodnikową. Profil uwalniania GSH z NP został wyznaczony w warunkach in vitro w pH 7,4 i jego przebieg wskazywał na bardzo szybkie uwalnianie substancji aktywnej (96 proc. uwolnienie GSH z NP po 5 minutach inkubacji w 37°C). Jednocześnie zaobserwowano bardzo wysoki stopień utlenienia GSH do disiarczku glutationu (GSSG). Poprawę profilu uwalniania GSH z NP‑GSH prawdopodobnie można uzyskać poprzez koenkapsulację GSH z innymi związkami, które przedłużałyby czas jego uwalniania z NP (np. cycklodekstryny).

Stres oksydacyjny (SO)
Definiuje się go jako niekontrolowany wzrost stężeń reaktywnych form tlenu (RFT) w organizmie, pojawiający się w czasie zaburzenia równowagi pomiędzy oksydantami a antyoksydantami [7]. Stres oksydacyjny pojawia się, gdy produkcja reaktywnych form tlenu (RFT) przekracza komórkową zdolność antyoksydacyjną do detoksykacji reaktywnych produktów [2]. Reakcje RFT z cząsteczkami organicznymi prowadzą do powstania wolnych rodników substancji organicznych, które mogą modyfikować i uszkadzać ważne makrocząsteczki komórkowe, np. kwasy nukleinowe, białka i lipidy [8]. W celu minimalizacji negatywnych efektów działania RFT, komórki mają system obrony antyoksydacyjnej, który może być natury enzymatycznej lub nieenzymatycznej. Do głównych enzymów antyoksydacyjnych usuwających RFT należą: dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza glutationowa oraz reduktaza glutationowa [4]. Do głównych nieenzymatycznych antyoksydantów, których istotnym źródłem jest pożywienie, należą witaminy A, E, C, a także beta-karoten, zredukowany koenzym Q, mikroelementy (Zn, Se, Cu, Mn) oraz polifenole i flawonoidy. Do endogennych cząsteczek wykazujących działanie antyoksydacyjne należą: zredukowany glutation (GSH), bilirubina, tioredoksyna, ceruloplazmina i albumina [1]. GSH jest jednym z najczęściej badanych wskaźników SO.

Glutation (γ-L-glutamylo-L-cysteinoglicyna)
To niskocząsteczkowy związek tiolowy o budowie tripeptydowej. Występuje on w komórkach wszystkich organizmów roślinnych oraz zwierzęcych i jest najobfitszym tiolem wewnątrzkomórkowym. Cechą charakterystyczną jego budowy jest obecność wolnej grupy sulfhydrylowej, nadającej reaktywność oraz potencjał redukujący. Utrzymuje on grupy tiolowe białek w stanie zredukowanym, co w wielu przypadkach jest niezbędne dla ich prawidłowego funkcjonowania [5]. Grupa tiolowa GSH reaguje z RFT, a ponadto regeneruje utlenione grupy sulfhydrylowe białek. Zredukowany GSH bardzo łatwo ulega utlenieniu do disiarczku glutationu – GSSG, który pozbawiony jest właściwości antyoksydacyjnych [9]. Zaburzenia w równowadze pomiędzy GSH
/GSSG zostały zaobserwowane w przypadku takich chorób, jak: nowotwory, cukrzyca typu 2, reumatyzm stawów, zakażenia wirusem HIV [3].

Do tej pory podejmowano tylko nieliczne próby enkapsulacji GSH w NP. Otrzymane NP-GSH oceniane były m.in. pod względem właściwości fizykochemicznych, wydajności enkapsulacji GSH oraz profilu uwalniania z NP. Ze względu na swe właściwości antyoksydacyjne GSH mógłby być zaliczony do grupy związków czekających na zastosowanie kliniczne. Jednak – podobnie jak inne peptydy oraz białka – podawany per os ulega szybkiej degradacji enzymatycznej. Powoduje to znaczący spadek stężenia GSH z jednoczesnym jego utlenieniem do GSSG, co skutkuje bardzo niską biodostępnością [9]. Poszukuje się więc technologii, które zapobiegałyby takim zjawiskom. Inkorporacja GSH w nowoczesną postać leku, która umożliwiłaby podanie doustne zredukowanego glutationu wydaje się bardzo korzystna.

Ze względu na dużą wrażliwość na chemiczną i enzymatyczną hydrolizę, jak również słaby wychwyt komórkowy, biodostępność białek w dalszym ciągu pozostaje bardzo niska. Spośród możliwych strategii zwiększania absorpcji leków, mikro- i nanocząstki stanowią interesującą próbę wzmocnienia wychwytu i transportu cząsteczek podanych per os [Delie et al., 2005].

Z farmaceutycznego punktu widzenia, polimerowe nanocząstki są szczególnie interesującą formą. Po pierwsze, są one bardziej stabilne niż inne koloidalne nośniki oraz mogą chronić zinkoroporowane leki przed środowiskiem przewodu pokarmowego. Po drugie, wykorzystanie różnych polimerowych materiałów umożliwia modulację właściwości fizykochemicznych (hydrofobowość, potencjał zeta), biologicznych (bioadhezja, poprawa wychwytu komórkowego) oraz właściwości uwalniania leku. Wyniki badań wykazują, że nanoenkapsulacja peptydów chroni je przed niekorzystnym środowiskiem przewodu pokarmowego i zwiększa transport dokomórkowy [des Rieux et al., 2006].

Metodyka i wyniki
NP-GSH, z różnymi początkowymi ilościami inkorporowanego GSH, otrzymano metodą podwójnej emulsji (W/O/W) i odparowania rozpuszczalnika organicznego opisaną przez Zambauksa w 1998 roku.
NP-GSH były otrzymane poprzez emulgowanie mieszaniny Eudragitu® RS 100 (polimer nierozpuszczalny w wodzie, rozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych) i GSH w dichlorometanie z wodnym roztworem substancji powierzchniowo czynnej – alkoholu poliwinylowego (PVA). Do wytworzenia emulsji zastosowano ultradźwięki, następnie odparowano rozpuszczalnik tak, by polimer nierozpuszczalny w wodzie wytrącił się w postaci bardzo drobnych cząstek, a substancja aktywna została w nim zatrzymana. Otrzymaną zawiesinę NP-GSH poddano procesowi liofilizacji, a NP-GSH scharakteryzowano pod względem wielkości, potencjału zeta, wydajności enkapsulacji oraz aktywności antyoksydacyjnej. Wyznaczono profile uwalniania GSH z NP i obliczono wydajność procesu formulacji pustych NP i NP‑GSH, która wynosiła odpowiednio 65,3 ± 7,1 i 66,8 ± 12,5 %. Wielkość badanych NP-GSH wynosiła 340-385 nm i nie różniła się znacząco od pustych nanocząstek (400,8 ± 59,0). Ładunek powierzchniowy przygotowanych NP-GSH był dodatni i wynosił 30‑44 mV. Potencjał zeta ma wpływ na przenikalność NP-GSH przez naładowane ujemnie komórki układu pokarmowego. Uzyskane wyniki badań wskazują, że zarówno proces liofilizacji, jak i zwiększanie początkowej ilości GSH inkorporowanego w NP nie ma wpływu na średnią wielkość i potencjał zeta przygotowanych NP.

Następnie określono stopień enkapsulacji GSH w NP. Zawartość GSH w NP została zbadana metodą pośrednią poprzez oznaczenie ilości GSH w supernatancie (pobranym po zakończeniu formulacji NP-GSH) oraz metodą bezpośrednią poprzez oznaczenie chromatograficzne (metoda HPLC) GSH w roztworze metanolowym po rozpuszczeniu NP-GSH. Wyniki oznaczeń GSH wykorzystano do obliczenia wydajności enkaspulacji GSH w NP. Oznaczana metodą bezpośrednią wynosiła 19-36%, a pośrednią 32-55% i nie zauważono wpływu wzrastającej początkowej ilości GSH na ten parametr. Choć uzyskane wyniki są niskie, to są one porównywalne lub nieco wyższe od tych zaobserwowanych z użyciem chitosanu (CS) w obecności cyklodekstryn (CD) (~25%) [3] i Eudragitu® RS 100 z CD (~21%) [6].

W kolejnym etapie pracy zbadano aktywność antyoksydacyją NP-GSH, wykorzystując rodnik 2,2’-difenylo-1-pikrylhydrazylowy (DPPH°), który wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali 515 nm. W obecności antyoksydantów roztwór DPPH° odbarwia się, a stopień tego odbarwienia mierzony jest spektrofotometrycznie, co pozwala określić właściwości antyoksydacyjne.

GSH zawarty w NP reagował z DPPH°, osiągając stan równowagi po 90 min. inkubacji w 20°C w mieszaninie metanolu z buforem cytrynianowym (95:5, v/v) i wykazywał aktywność antyrodnikową. Profil uwalniania GSH z NP został wyznaczony w warunkach in vitro w pH 7,4 i jego przebieg wskazywał na bardzo szybkie uwalnianie substancji aktywnej, wynoszące 96% po 5 min. inkubacji NP‑GSH w 37°C. Jednocześnie zaobserwowano bardzo wysoki stopień utlenienia GSH do disiarczku glutationu (GSSG). W pH większym od 7 GSH utlenia się szybko i nieenzymatycznie. Zwiększone ilości GSSG zostały oznaczone jednocześnie ze zmniejszającym się poziomem GSH. Przedłużenie uwalniania GSH z NP prawdopodobnie można uzyskać poprzez enkapsulację GSH z innymi związkami np. CD, które korzystnie wpływają na profil uwalniania w pH mniejszym niż 7 [6] lub też połączyć Eudragit® RS z innym polimerem.

Przeprowadzone badania wykazały możliwość enkapsulacji glutationu w nanocząstki polimerowe oraz wykazywały one właściwości antyoksydacyjne. Mając na uwadze niesatysfakcjonujący przebieg profilu uwalniania GSH konieczne jest prowadzenie dalszych badań nad optymalizacją profilu uwalniania.

Piśmiennictwo
1. Bartosz G., Druga twarz tlenu, 2003, wyd. PWN Warszawa.
2. Curtin J. F., Donovan M., Cotter T. G., Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis, J. Immun. Methods, 2002, 265, 49-72.
3. Ieva E., Trapani A., Cioffi N., Ditaranto N., Monopoli A., Sabbatini L., Analytical characterization of chitosan nanoparticles for peptide drug delivery applications, Anal. Bioanal. Chem., 2009, 393, 207-215.
4. Jos A., Cameán A.M., Pflugmacher S., Segner H, The antioxidant glutathione in the fish cell lines EPC and BCF-2: Response to model pro-oxidants as measured by three different fluorescent dyes, Toxicology in vitro, 2009, 23, 546-553.
5. Kidd P.M. Glutathione: systemic protectant against oxidative and free radical damage, Altern. Med. Rev., 1997, 1, 155-176.
6. Lopedota A., Trapani A., Cutrignelli A., Laquintana V., Denora N., Franco M., Trapani G., LisoG., Effect of cyclodextrins on physico-chemical and release properties of Eudragit RS 100 microparticles containing Glutathione, J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem, 2007, 57, 425-432.
7. Sies H. Role of reactive oxygen species in biological processes, Klinische Wochenschrift, 1991, 69, 965-968.
8. Storz G., Tartaglia A.L., Farr S.B., Ames B.N., Bacterial defenses against oxidative stress, Tig., 1990, 6, 363-368.
9. Trapani A., Laquintana V., Denora N., Lopedota A., Cutrignelli A., Franco M., Trapani G., Liso G., Eudragit RS 100 microparticles containing 2-hydroxypropyl-_-cyclodextrin and glutathione: Physicochemical characterization, drug release and transport studies’’. Eur. J. Pharm. Sci., 2007, 30, 64-74.
10. Zambauxa M. F., Bonneauxa F., Grefb R., Maincent P., Dellacherieb E., Alonsod M. J., Labrude P. , Vigneron C., Influence of experimental parameters on the characteristics of poly(lactic acid) nanoparticles prepared by a double emulsion method, J. Control. Release, 1998, 50, 31-40.