Diagnostyka chorób nerwowo-mięśniowych

Do diagnostyki poszczególnych chorób nerwowo-mięśniowych wybiera się metodę, która szybko i tanio da wiarygodny wynik. Obecnie dąży się do opracowania testów, dzięki którym można rozpoznać pierwotną przyczynę choroby.

Mianem chorób nerwowo-mięśniowych określa się wszelkie jednostki chorobowe, które w swojej pierwotnej patologii upośledzają sferę motoryczną, począwszy od komórek rogów przednich rdzenia kręgowego, a skończywszy na samych mięśniach. Cechą wspólną chorób nerwowo-mięśniowych jest osłabienie siły mięśniowej.

Choroby te diagnozuje się w badaniach: biochemicznych, immunocytochemicznych oraz genetycznych. Dodatkowo wykonuje się: EMG, EKG, USG serca, spirometrię i gazometrię.

Dystrofia mięśniowa Duchenne`a/ Beckera (DMD/ BMD)
Choroba ta polega na stopniowym i nieodwracalnym zaniku mięśni. Zarówno jej ostrą (opisaną przez Duchenne’a), jak i łagodną (opisaną przez Beckera) postać wywołuje mutacja genu położonego na krótkim ramieniu chromosomu X. Choroba ta jest dziedziczona w sposób recesywny sprzężony z płcią, tj. chorują na nią chłopcy, a kobiety są jedynie nosicielkami.

Najczęstszym rodzajem uszkodzenia genu DMD są różnej wielkości delecje, które stanowią 60 proc. wszystkich mutacji. Duplikacje fragmentu genu spotyka się u 5-15 proc. chorych, a pozostałe mutacje to tzw. mutacje punktowe. W rzeczywistości „mutacje punktowe” są uszkodzeniami zarówno jednonukleotydowymi (prawdziwe mutacje punktowe), jak i kilku-, kilkunastonukleotydowymi zmianami typu delecja czy duplikacja.

Uszkodzenia sekwencji kodującej białko, pozwalające na syntezę cząsteczki częściowo skróconej, ale zawierającej zasadnicze jej elementy, powodują łagodniejszy przebieg choroby. Natomiast mutacje, których skutkiem jest całkowity brak dystrofiny we włóknie mięśniowym, powodują ostry przebieg dystrofii mięśniowej.

Bardzo rzadko dystrofię mięśniową Duchenne’a/ Beckera diagnozuje się u kobiet (objawowe nosicielki). Wywołują ją dwie mutacje: pierwsza uszkadza gen dystrofiny, druga – system inaktywacji chromosomu X, prowadząc do wyciszenia chromosomu z prawidłową kopią genu dystrofiny.

Diagnostyka molekularna DMD/ BMD
Polega na wykrywaniu mutacji w genie dystrofiny. Stosowana przed laty technika hybrydyzacji do badanego DNA osoby chorej znakowanych radioizotopami sond molekularnych pozwalała na wykrywanie delecji i duplikacji, była jednak bardzo pracochłonna. Zastąpiła ją znacznie szybsza technika PCR-multipleks. Niestety dzięki niej można było znaleźć tylko delecje i to w wybranych obszarach genu. Najnowsza technika – multipleksowa amplifikacja połączonych działaniem ligazy sond molekularnych (MLPA) – połączyła w jedno działanie dawną hybrydyzację i PCR. Produkty reakcji rozdziela się w sekwenatorze kapilarnym, a uzyskane wyniki analizuje przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Badanie to pozwala na wykrycie wszystkich delecji i duplikacji w obrębie sekwencji kodującej białko. Ponadto, pozwala ocenić ilość badanych eksonów w DNA wyizolowanym od kobiet, co z kolei pozwala ustalić, czy są one nosicielkami delecji lub duplikacji w genie dystrofiny. Zaletą MLPA jest to, że wynik otrzymuje się w ciągu 2 dni, natomiast wadą – wysoka cena odczynników. Niestety, poza zakresem działania techniki MLPA pozostają tzw. mutacje punktowe, które można wykrywać jedynie sekwencjonując gen.

W naszym laboratorium w niepełnym zakresie poszukujemy mutacji punktowych, selekcjonując odcinki metodą SSCP (single strand conformation polimorphism) do finalnego sekwencjonowania. Wydłuża to czas oczekiwania na wynik, jednak znacznie redukuje koszty badania. Wynik sekwencjonowania wymaga porównania otrzymanej sekwencji nuklotydowej z sekwencją referencyjną i oceny wykrytych różnic. Jedynie zmiany w badanym DNA powodujące zmianę informacji genetycznej (powstanie kodonu stop, przesunięcie ramki odczytu, zamiana aminokwasu na inny) mogą być uważane za mutacje chorobotwórcze.

Opisane powyżej badania wykonuje się jako weryfikację rozpoznania klinicznego. Wskazaniem jest podwyższenie poziomu aktywności kinazy kreatyny w krwi osoby badanej. Niestety aktywność tego enzymu nie zawsze koreluje z mutacją w genie dystrofiny, dlatego niekiedy trzeba wykonać kosztowne badania genetyczne.

Rdzeniowy zanik mięśni (SMA)
Choroba ta charakteryzuje się zwyrodnieniem i obumieraniem neuronów ruchowych rogów przednich rdzenia kręgowego, co prowadzi do postępującego niedowładu i zaniku mięśni. Obraz kliniczny choroby jest bardzo zróżnicowany. W najostrzejszych przypadkach objawy pojawiają się już w życiu płodowym – kobiety ciężarne zwracają uwagę na słabnięcie ruchów płodu pod koniec ciąży. W najłagodniejszych przypadkach choroby niedowład występuje dopiero w wieku dorosłym. Na SMA chorują zarówno kobiety, jak i mężczyźni. Chorobę dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny, więc oboje rodzice muszą być jej nosicielami.

Za wystąpienie rdzeniowego zaniku mięśni odpowiedzialne są mutacje w położonym na długim ramieniu chromosomu 5 genie SMN1. Badania wykazały, że w 95 proc. przypadków SMA stwierdza się delecje w obu kopiach genu SMN1 (homodelecja). Prawidłową diagnostykę utrudnia, położony w tym samym obszarze co gen SMN1, gen SMN2. Białkowy produkt tego genu, choć nieco krótszy, może w niewielkim stopniu kompensować brak właściwego białka SMN. Na szczęście różnią się one trzema jednonukleotydowymi podstawieniami.

Diagnostyka molekularna SMA
Polega ona na namnożeniu w reakcji PCR wybranego fragmentu genów SMN1 i SMN2 (tego z jednonukleotydową różnicą), a następnie przecięciu go odpowiednim enzymem restrykcyjnym na dwie części. Ta jednonukleotydowa różnica powoduje, że produkt reakcji PCR, będący kopią sekwencji genu SMN1, poddaje się trawieniu, zaś produkt będący odwzorowaniem fragmentu genu SMN2 pozostaje nieprzecięty. Po elektroforetycznym rozdziale otrzymanych fragmentów i ich wizualizacji w świetle UV otrzymany obraz, w którym brak jest produktów trawienia, świadczy o delecji w obu kopiach genu SMN1, a tym samym potwierdza kliniczną diagnozę. W rzadkich przypadkach SMA, gdy w jednej kopii genu jest delecja, zaś w drugiej mutacja punktowa, nie wykrywa się delecji.

Diagnostyka pozostałych przypadków SMA, jak również poszukiwanie bezobjawowych nosicieli SMA, wymaga zastosowania omówionej wcześniej techniki MLPA.

Dystrofia miotoniczna (DM)
Choroba ta charakteryzuje się osłabieniem mięśni kończyn i twarzy oraz miotonią. Uszkodzony może być też ośrodkowy układ nerwowy, co przejawia się zaburzeniami osobowości i nadmierną sennością. Choroba ta jest dziedziczona w sposób autosomalny dominujący. Przyczyną DM są mutacje dynamiczne w genie DMPK, położonym na chromosomie 19. Białkowym produktem genu jest miotonina – kinaza proteinowa dystrofii miotonicznej, występująca w złączu nerwowo-mięśniowym.

Mutacje dynamiczne, leżące u podłoża wielu chorób neurodegeneracyjnych, polegają na zwielokrotnieniu w ciągu powtórzeń trójek nukleotydowych. W dystrofii miotonicznej jest to trójka CTG. Prawidłowa liczba trójek zawiera się w przedziale 5-35 powtórzeń CTG. Przekroczenie liczby 50 trójek wywołuje DM. Obserwuje się silną korelację pomiędzy liczbą powtórzeń a nasileniem miotonii. Chorzy z łagodną postacią choroby wykazują 50-80 powtórzeń CTG, natomiast w ciężkiej postaci wykrywa się ich 2000. Największe rozmiary powtórzeń stwierdzano u dzieci z wrodzoną dystrofią miotoniczną.

Diagnostyka molekularna dystrofii miotonicznej
Polega na amplifikacji za pomocą reakcji PCR wybranego odcinka genu DMPK, zawierającego powtórzenia CTG, i rozdziale otrzymanych produktów w sekwenatorze. Wizualizacja rozdzielanych fragmentów jest możliwa dzięki wyznakowaniu produktów PCR barwnikami fluorescencyjnymi. Ze względu na wysoki polimorfizm liczby powtórzeń trójek CTG na ogół otrzymuje się dwa produkty różnej długości. U osób zdrowych oba mieszczą się w zakresie 5-35, zaś u osób mających mutacje odnajduje się jeden produkt o wielkości prawidłowej, a drugi znacznie powiększony.

Choroba Pompego (glikogenoza)
To bardzo rzadka choroba, której podłożem jest zaburzenie metabolizmu glikogenu. Objawy kliniczne przypominają objawy dystrofii mięśniowej Beckera, jednak ich podłożem jest obniżona aktywność zlokalizowanej w lizosomach kwaśnej maltazy, odpowiedzialnej za katabolizm glikogenu. Skutkiem słabej lub śladowej aktywności maltazy jest gromadzenie glikogenu w mięśniach szkieletowych, mięśniu sercowym, wątrobie, nerkach i ośrodkowym układzie nerwowym. Uszkodzenie włókien mięśniowych wynika z nadmiernego gromadzenia glikogenu, prowadząc do mechanicznych przesunięć i ucisku organelli w komórce.

Diagnostyka choroby Pompego
Odbywa się ona na poziomie biochemicznym. W przypadku tej choroby – choć znany jest gen, którego mutacje uszkadzają kwaśną maltazę – znacznie łatwiej jest oznaczyć jego aktywność enzymatyczną niż poszukiwać nieznanych pojedynczych mutacji punktowych. Chorobę tę diagnozuje się poprzez oznaczenie aktywności kwaśnej maltazy w suchej kropli krwi.