Plazmidowe preparaty genowe

Obiecujące wyniki badań naukowych i klinicznych prowadzonych na plazmidowych preparatach genowych wskazują, iż w niedalekiej przyszłości mogą one pojawić się na aptecznych półkach.

Od ponad 15 lat nowoczesna farmakoterapia korzysta z preparatów genowych, których potencjał leczniczy utożsamiany jest z genami kodującymi terapeutyczne białka. Obecnie aplikacja kliniczna preparatów genowych sprowadza się przede wszystkim do ograniczonych prób klinicznych terapii genowej o charakterze eksperymentalnym. Jak dotąd liczba protokołów klinicznych na świecie przekroczyła 1000 prób, w Polsce prowadzonych jest zaledwie kilka – głównie chorób nowotworowych i naczyniowo-sercowych.

W zależności od rodzaju nośnika genów (wirusowy lub niewirusowy) w klinice stosuje się preparaty genowe w postaci rekombinowanych wirusów bądź ekspresyjnych plazmidów. W wielu próbach klinicznych wykorzystywane są wektory plazmidowe z wklonowanymi genami kodującymi terapeutyczne białka, czyli plazmidowe preparaty genowe.

Wprowadzanie genów do komórek
Geny do komórek można wprowadzić:

• metodą ex vivo – pobrane od pacjenta komórki (najczęściej komórki krwi) poddaje się manipulacjom genetycznym w warunkach in vitro, a drogą bezpośredniej transfekcji wprowadzany jest do nich terapeutyczny gen; transfekowane komórki są następnie pasażowane, analizowane w kierunku ekspresji wprowadzonego genu, po czym wszczepiane z powrotem do organizmu pacjenta;
• metodą systemowego podania preparatu genowego – podany donaczyniowo wektor kodujący terapeutyczny gen, osiągnąwszy wybraną tkankę i narząd, ulega ekspresji. Preparat genowy podawany jest np. domięśniowo, a jego białkowy produkt wywiera terapeutyczne działanie o wymiarze systemowym;
• metodą bezpośredniego wprowadzenia terapeutycznego genu (wektora) do określonej tkanki, narządu pacjenta, np. do niedokrwionego mięśnia sercowego lub guza nowotworowego.

Plazmidy
Stosowane w systemie niewirusowym wektory plazmidowe wywodzą się z naturalnie występujących u bakterii bądź grzybów plazmidów. Naturalne plazmidy nie niosą genów metabolizmu podstawowego mikroorganizmów, a ich obecność warunkuje określone cechy funkcjonalno-fenotypowe gospodarza, które nierzadko stanowią o atrakcyjności biologicznej, ekologicznej mikroorganizmu. Są to najczęściej: oporność na chemiczne substancje toksyczne środowiska (w tym również antybiotyki), oporność na promieniowanie ultrafioletowe, zdolność do degradacji zanieczyszczeń środowiskowych, zdolność do wiązania azotu atmosferycznego.

W terapii genowej wykorzystywane są – przygotowane metodami inżynierii genetycznej – plazmidy ekspresyjne (rys.). Pozwalają one na otrzymanie dużych ilości mRNA kodującego terapeutyczne białko.

Plazmidy ekspresyjne zawierają:

• kasety ekspresyjne wyposażone w silne promotory, w terminujące je sekwencje poliadenylacji (stabilizujące powstałe mRNA i chroniące przed komórkowymi nukleazami);
• silne bakteryjne bądź wirusowe replikony umożliwiające wysokokopijną replikację wektora w komórkach bakteryjnych;
• sekwencje markerowe – bardzo często są to geny oporności na antybiotyki, cytostatyki (np. geny oporności na ampicylinę, neomycynę, chloramfenikol, tetracykliny, bleomycynę) lub geny, których białkowe produkty posiadają właściwości fluorescencji pod wpływem światła (GFP, RFP).

Plazmidowe preparaty genowe
Preparaty genowe otrzymuje się metodami inżynierii genetycznej, najczęściej ze stransformowanych badanym wektorem bakterii Escherichia coli. Markery selekcyjne plazmidów pozwalają na selekcję klonów i uzyskiwanie pożądanego preparatu. W zależności od charakteru badań i przeznaczenia wektora skala uzyskiwania plazmidów i związane z nią procedury preparatyki mogą się różnić, choć można omawiać charakterystyczne wspólne etapy.

Większość procedur izolacji plazmidów z bakterii wykorzystuje metodę lizy bakterii w warunkach alkalicznych, precypitację w środowisku kwaśnym i dalsze etapy izolacji/ oczyszczania zależne od skali produkcji. Najnowsze systemy izolacji/ oczyszczania plazmidów opierają się na metodach chromatograficznych. W przypadku preparatyki plazmidów należy podkreślić, że istnieją różne formy topologiczne plazmidów, a ich występowanie wiąże się przede wszystkim z jakością procedury izolacji.

Postacią o najwyższej aktywności biologicznej jest postać superzwinięta, czyli dwuniciowa, kowalentnie zamknięta forma ccc (ang. covalently closed circle). Oprócz ccc w preparatach plazmidowych mogą być obecne formy oc (ang. open circular) oraz l (ang. linear form). Jakość preparatu bezpośrednio zależy od przebiegu procedury izolacji plazmidu.

Dobra praktyka wytwarzania (GMP)
Preparaty plazmidowe, jak i wszystkie inne preparaty wykorzystywane w próbach klinicznych terapii genowej (plazmidy, wirusy, komórki), muszą być – według wytycznych Unii Europejskiej – wytwarzane zgodnie z zasadami dobrej praktyki wytwarzania (GMP). Postępowanie zgodnie z GMP obejmuje zarówno procesy wytwarzania plazmidów, jak i ich pakowania, przechowywania, transportu i sprawdzania jakości. Preparaty plazmidowe przygotowane do prób klinicznych muszą posiadać pełną dokumentację uwzględniającą wyniki szeregu badań biochemicznych, mikrobiologicznych, toksykologicznych, farmakokinetycznych prowadzonych zarówno w warunkach in vitro, jak i na zwierzętach laboratoryjnych.

Ścisła charakterystyka jakości i czystości otrzymanego preparatu plazmidowego jest niezbędna do jego wykorzystania w warunkach klinicznych. Wpływa ona nie tylko na efektywność terapeutyczną badanego preparatu, lecz także – a może przede wszystkim – na bezpieczeństwo jego stosowania u pacjentów.

Obecnie plazmidowe preparaty genowe wykorzystywane są w próbach klinicznych terapii genowej. W Polsce prowadzone są badania kliniczne, w których wykorzystuje się plazmidy kodujące czynniki regulujące procesy związane z angiogenezą. Pacjenci cierpiący na choroby niedokrwienne otrzymują preparaty genowe celem poprawy bądź odbudowy unaczynnienia np. mięśnia sercowego. Stosowane preparaty mają postać iniekcyjną – są to roztwory plazmidowego DNA w soli fizjologicznej. Dynamiczny rozwój metod inżynierii genetycznej i farmacji stosowanej upoważnia do dyskusji i prowadzenia badań nad nowymi postaciami środków leczniczych – plazmidów, a także pozwala formułować pytania dotyczące czasu oraz dostępności preparatów genowych w aptece. Obiecujące wyniki uzyskiwane przez naukowców, jak i klinicystów wskazują, iż obecność preparatów genowych na aptecznych półkach może być niedaleką przyszłością.

#Sche­mat bu­do­wy eks­pre­syj­ne­go wek­to­ra pla­zmi­do­we­go

tekst:
dr n. med. mgr farm. Maciej Małecki
Zakład Biologii Komórki,
Centrum Onkologii – Instytut
im. M. Skłodowskiej-Curie, Warszawa
Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny AM w Warszawie
mgr farm. Katarzyna Gromek
Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny AM w Warszawie