Ammi majus L. – kultury in vitro i produkcja metabolitów wtórnych

Hodowle roślinne in vitro mogą być alternatywnym źródłem otrzymywania metabolitów wtórnych.
Jedną z grup metabolitów o interesujących właściwościach biologicznych są połączenia kumarynowe, a szczególnie furanokumaryny.

Charakterystyka Ammi majus L.
Ammi majus L. (Aminek większy) jest rośliną subtropikalną z rodziny Apiaceae (Baldaszkowate), szeroko rozpowszechnioną w stanie naturalnym w rejonie Morza Âródziemnego. Spotykany jest również na innych kontynentach w obszarach o podobnym klimacie, jak południowa część Stanów Zjednoczonych, Argentyna, rzadziej w Australii i Nowej Zelandii. Ze względu na chłodniejszy klimat nie występuje w stanie naturalnym w Polsce oraz w wielu krajach Europy Ârodkowej i Wschodniej.

Aminek większy jest uważany za najbogatsze naturalne źródło furanokumaryn typu psoralenu (gł. bergapten, ksantotoksyna, metoksypsoralen). Zawiera również proste kumaryny (gł. umbeliferon), furanokumaryny typu angeliciny, flawonoidy (gł. kwercetyna) oraz olejek lotny.

Występowanie furanokumaryn ograniczone jest do kilku rodzin: Rutaceae, Apiaceae, Fabaceae, Moraceae, Orchidaceae. Magazynowane są w nasionach, owocach i korzeniach.

Działanie i zastosowanie lecznicze
Zastosowanie aminka jako surowca leczniczego ma długą tradycję. Już w starożytnym Egipcie znane były i wykorzystywane jego właściwości terapeutyczne. Stosowano go w leczeniu bielactwa oraz jako spasmolyticum w kolce nerkowej i skurczach moczowodu. Tłumaczyć to można obecnością prostych kumaryn wykazujących działanie spazmolityczne na mięśnie gładkie przewodu pokarmowego, dróg żółciowych, układu moczowego oraz obwodowych naczyń krwionośnych i połączeń furanokumarynowych, które posiadają właściwości: fotouczulające (należą do tzw. fotosensybilizatorów – związków uczulających skórę ludzką na promieniowanie UV; związki te wpływają na proces powstawania melaniny – barwnika skóry, przyspieszają repigmentację odbarwionej skóry przy współudziale światła); antyproliferacyjne; mutagenne; wykazują zdolność blokowania kanałów potasowych oraz, według najnowszych badań, kanałów wapniowych w mięśniu sercowym. Warto dodać, że dihydrofuranokumaryny posiadają działanie spazmolityczne porównywalne z działaniem papaweryny.

Do schorzeń leczonych tymi związkami należą m.in.: bielactwo nabyte (vitiligo), łuszczyca (psoriasis), ziarniniak grzybiasty (mycosis fungoides), atopowe zapalenie skóry (atopic eczema), pokrzywka barwnikowa (urticaria pigmentosa), łysienie plackowate (alopecia areata), liszaj płaski (lichen planus), przyłuszczyca plackowata (parapsoriasis en plaques) i przyłuszczyca ostra (pityriasis lichenoides).

Furanokumaryny stosowane są w ramach tzw. terapii PUVA (psoraleny + promieniowanie UVA), polegającej na stosowaniu bergaptenu lub ksantotoksyny doustnie na 2 godziny przed naświetlaniem promieniami UVA (po tym czasie jest osiągane stężenie w naskórku i skórze właściwej). Fotochemioterapia jest najbardziej skuteczną terapią leczenia łuszczycy, jednak nie zapobiega nawrotom choroby.

W przypadku bielactwa nabytego stosuje się leczenie miejscowe równocześnie z leczeniem ogólnym. Plamy bielacze smaruje się roztworem zawierającym ksantotoksynę o różnym stężeniu i naświetla się promieniami ultrafioletowymi. Fotochemioterapię wykorzystuje się też w leczeniu łysienia plackowatego. Preparaty stosowane w dermatologii zawierają ksantotoksynę uzyskiwaną na skalę przemysłową drogą syntetyczną.

Kierunki badań biotechnologii roślinnej
Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną nauki, która obejmuje różne kierunki wykorzystywania materiałów i procesów biologicznych. Obejmuje ona procesy biosyntezy i biotransformacji oraz zajmuje się również izolacją i badaniem otrzymanych tą drogą bioproduktów.

Obecnie biotechnologia roślinna rozwijana jest w kilku kierunkach. Jednym z nich jest hodowla roślin – opracowanie metod szybkiego różnicowania się komórek, regeneracji pędów i mikropropagacji (mikrorozmnażanie) roślin o identycznych cechach użytkowych oraz selekcja i tworzenie nowych odmian roślin. Natomiast drugim – jest hodowla in vitro komórek i tkanek roślinnych normalnych lub zmodyfikowanych genetycznie w celu otrzymywania biologicznie aktywnych metabolitów wtórnych. Niektóre związki otrzymuje się już obecnie w ilości dwu- a nawet dwudziestokrotnie większej niż z rośliny Hodowle in vitro mają ogromne znaczenie praktyczne. Dostarczają materiału roślinnego, niezależnie od pory roku i stref klimatycznych, przyczyniają się do wielokrotnego skrócenia cyklu produkcyjnego oraz zwiększenia wydajności biosyntezy, biotransformacji i koncentracji związków aktywnych biologicznie. Rozwój biotechnologii pozwala też na zaspokojenie rosnącego zapotrzebowania na dane produkty. Służy on także ochronie rzadkich roślin, z których otrzymuje się niektóre ważne substancje czynne.

Na powodzenie rozwoju biotechnologii wpływa wiele czynników – jednym z nich jest sfera finansowa. Prace badawcze, rozwiązywanie problemów technicznych związanych z hodowlami in vitro wymagają dużego nakładu finansowego. Obecnie podstawowym kryterium decydującym o wdrożeniu nowej technologii jest jej opłacalność. Wymaga ona dużej wydajności produktu, jego wysokiej ceny, odpowiednio dużego i stabilnego rynku zbytu oraz ograniczonej dostępności z tradycyjnych źródeł.

Część doświadczalna
Hodowle Ammi majus L. prowadzono na podłożu Linsmaiera-Skooga (LS) z dodatkiem różnych ilości substancji wzrostowych: NAA i BAP. Prowadzono dwa typy hodowli kalusowych: agarowe – na szalkach Petri’ego; i zawiesinowe – w kolbach Erlenmayera. Tkanka kalusowa charakteryzowała się różnym wyglądem zewnętrznym w zależności od podłoża hodowlanego (różnej ilości NAA – kwas -naftalenooctowy i BAP – 6-benzyloaminopuryna) i rodzaju hodowli. Prześledzono dynamikę wzrostu w obu typach hodowli na różnych podłożach (wyznaczono przyrosty świeżej i suchej biomasy).

Chcąc określić wpływ ilościowej zawartości substancji wzrostowych oraz typ prowadzonej hodowli na akumulację połączeń kumarynowych w tkankach kalusowch Ammi majus L., przeprowadzono wysokociśnieniową chromatografię cieczową (HPLC). Analizie poddano ekstrakty przygotowane z wysuszonych i rozdrobnionych tkanek kalusowych, a także z pożywek hodowli zawiesinowej. Wykazano wpływ rodzaju hodowli oraz ilościowej zawartości substancji wzrostowych zarówno na przyrosty biomasy, jak i na akumulację metabolitów aktywnych. W celu izolacji wybranych frakcji metabolitów wykorzystano metodę chromatografii preparatywnej (prep. TLC), a do identyfikacji tych związków użyto metodę spektrometrii masowej oraz magnetycznego protonowego rezonansu jądrowego (1H-NMR). Na podstawie analizy widm spektralnych (EI-MS i 1H-NMR) udało się zidentyfikować jeden ze związków wyizolowanych z hodowli agarowej. Był nim umbeliferon. Izolację i identyfikację umbeliferonu należy uznać za istotny element pracy, ponieważ poprzednia próba jego izolacji i identyfikacji zakończyła się niepowodzeniem. Natomiast dwóch pozostałych wyizolowanych związków nie udało się zidentyfikować.

#Substancje roślinne otrzymywane z kultur in vitro na skalę przemysłową lub wdrażanych do produkcji

.