Badania fitochemiczne Saponariae radix

Aby surowiec został umieszczony w FP IV wystarczyło podać opis jego cech morfologicznych i anatomicznych oraz wymagania dotyczące czystości. W niektórych przypadkach podawano zawartość związków czynnych i metodę, według której należało je oznaczyć. Obecnie dodatkowo wymagane są badania jakościowe (badania chromatograficzne) oraz opis standaryzacji danego surowca.

Mydlnica lekarska od dawna jest surowcem farmakopealnym. Została zaproponowana także do FP V, pod warunkiem opracowania odpowiednich metod wykrywania i oznaczania zawartości związków farmakologicznie czynnych. Problem jest istotny, ponieważ w FP V będzie to jedyny, obok Glycyrrhizae radix surowiec saponinowy. Nie przewidziano bowiem monografii Primulae radix (Primula officinalis L. jest gatunkiem chronionym) ani Senegae radix (surowiec importowany). Surowce saponinowe są składnikiem mieszanek ziołowych, a także syropów czy tabletek o działaniu wykrztuśnym. Glycyrrhizae radix nie jest chętnie akceptowany w preparatach OTC przez lekarzy z uwagi na istotny wpływ na gospodarkę elektrolitową i wtórne zatrzymywanie wody w organizmie (obrzęki), a także podwyższanie ciśnienia krwi. Dlatego też celem pracy było po pierwsze, opracowanie warunków chromatograficznego wykrywania głównych związków czynnych Saponariae radix, a po drugie, opracowanie metod oznaczania zawartości związków czynnych tego surowca oraz oznaczenie wskaźnika hemolitycznego i wskaźnika pienienia.

Badania chromatograficzne

Badania te miały na celu opracowanie warunków chromatograficznej identyfikacji związków czynnych – głównie saponin, występujących w Saponariae radix. Surowiec do badań stanowiły pocięte i wysuszone korzenie mydlnicy lekarskiej, pochodzące z preparatów handlowych firm Herbapol Lublin i Kawon oraz surowiec pochodzący ze zbiorów własnych.W metodzie tej stosowano chromatografię cienkowarstwową na płytkach firmy Merck, pokrytych żelem krzemionkowym (DC-Fertigplatten Kieselgel 60. Art. nr 5626) oraz celulozą (DC-Fertigplatten Cellulose Art. nr 5638).

Badania chromatograficzne wyciągów niehydrolizowanych z Saponariae radix

Na punkty startowe nanoszono po 0,02 ml badanych wyciągów i po 0,01 ml roztworów saponin wzorcowych (saponina S firmy Merck, saponina firmy Roth i gypsogenina) o stężeniu 5 mg/ml.
Do rozwijania chromatogramów stosowano następujące fazy ruchome:

• n-butanol: kwas octowy: woda (66: 17: 17)
• n-butanol: kwas octowy: woda (5: 1: 5)
• n-butanol: kwas octowy: woda (6: 1: 5)
• n-butanol: etanol: 25% amoniak (62,5: 12,5: 25)

Chromatografy po rozwinięciu i wysuszeniu spryskiwano:

• 20% etanolowym roztworem kwasu fosforowolframowego i ogrzewano przez 10 min w temperaturze 1200C
• stężonym roztworem kwasu siarkowego i ogrzewano w temperaturze 1200C
• roztworem aldehydu anyżowego – do 0,5 ml aldehydu anyżowego dodano: 10 ml lodowatego kwasu octowego, 85 ml metanolu i 5 ml stężonego kwasu siarkowego i ogrzewano przez 10 min w temperaturze 1200C
• roztworem chlorku żelaza (III) – 75 mg chlorku żelaza rozpuszczono w 50 ml lodowatego kwasu octowego i oziębiając dodano 50 ml stężonego kwasu siarkowego
• parami jodu
• zawiesiną krwi w żelatynie (w celu stwierdzenia aktywności hemolitycznej badanych związków)

Wykryte chromatograficznie związki wykazują silne właściwości hemolityczne. Niestety rozdział chromatograficzny plam przy zastosowaniu wyżej wymienionych faz ruchomych okazał się niewystarczający.

Analiza chromatograficzna wyciągów z Saponariae radix poddanych hydrolizie kwaśnej

W związku ze słabym rozdziałem chromatograficznym plam w wyciągach niehydrolizowanych postanowiono wykonać badania chromatograficzne dla wyciągów poddanych hydrolizie za pomocą 7% kwasu solnego.Badania prowadzono na płytkach szklanych firmy Merck pokrytych żelem krzemionkowym. Na punkty startowe nanoszono po 0,02 ml roztworu otrzymanego w wyniku hydrolizy sapogenin oraz po 0,01 ml hydrolizowanych (analogicznie jak badany wyciąg) roztworów saponin wzorcowych (saponina S firmy Merck i saponina firmy Roth) o stężeniu 5 mg/ml.

Do rozwijania chromatografów używano następujących faz ruchomych:

• chloroform: metanol: cykloheksan (60: 5: 5)
• chloroform: metanol: cykloheksan (60: 5: 3,5)
• chloroform: metanol: cykloheksan: n-propanol (60: 5: 5: 2)

Rozwinięte i wysuszone chromarogramy wywoływano tymi samymi odczynnikami co w badania chromatograficzne wyciągów niehydrolizowanych z Saponariae radix.Najbardziej selektywny rozdział poszczególnych składników występujących w zespole hydrolizowanych saponin uzyskano stosując fazę metanol: cykloheksan: n-propanol (60: 5: 5: 2). Wykryte związki wykazują silne właściwości hemolityczne.

Analiza chromatograficzna cukrów występujących w hydrolizowanych wyciągach z Saponariae radix

Badanie prowadzono na płytkach celulozowych firmy Merck. Na punkty startowe nakładano po 0,02 ml roztworu badanego i 0,01 ml roztworów wzorcowych arabinozy, ramnozy, ksylozy, fruktozy, glukozy, kwasów glukuronowego i galakturonowego o stężeniu 5 mg/ml. Chromatogram rozwijano dwukrotnie fazą ruchomą n-butanol: pirydyna: woda (6: 4: 3). Rozwinięty chromatogram suszono na powietrzu i spryskiwano ftalanem aniliny, a następnie ogrzewano w temperaturze 1050C przez 5-10 minut.

W badanych wyciągach wykryto: ksylozę i arabinozę oraz prawdopodobnie galaktozę i glukozę.Po zakończeniu analizy metodą chromatografii cienkowarstwowej rozpoczęto badanie wskaźnika hemolitycznego oraz wskaźnika pienienia – liczby pianowej.

Oznaczenie wskaźnika hemolitycznego metodą Mazurek

Oznaczenie polega na określeniu wskaźnika hemolitycznego tj. takiego rozcieńczenia wyciągu z badanego surowca, które jeszcze całkowicie hemolizuje 1% zawiesinę krwinek. Wskaźnik hemolityczny badanych roztworów mieścił się w granicach 554-2419. Największą aktywność hemolityczną wykazywały wyciągi po 33 godzinach.

Oznaczenie wskaźnika pienienia – liczby pianowej

Oznaczenie polega na ustaleniu granicznego rozcieńczenia wyciągu z surowca lub saponiny, przy którym w określonych warunkach postępowania powstaje warstwa piany wysokości 1 cm, utrzymująca się przez 15 minut. Wartość wskaźnika pienienia dla badanych wyciągów wynosiła około 6300.

Wnioski

• Dla wyciągów hydrolizowanych dobrano odpowiednie warunki chromatograficzne, umożliwiając dobry rozdział związków, co może służyć do identyfikacji korzenia mydlnicy.
• W przypadku wyciągów niehydrolizowanych konieczne jest prowadzenie dalszych badań nad opracowaniem optymalnych warunków rozdziału chromatograficznego poszczególnych związków.
• W trakcie badań chromatograficznych stwierdzono, że zawiesina krwi w żelatynie jest czułym odczynnikiem wywołującym – dzięki niej wykryto obecność związków w wyciągach niehydrolizowanych oczyszczonych, które były niewidoczne po zastosowaniu odczynników chemicznych.
• Po zbadaniu jedynie trzech próbek surowca nie można przyjąć wskaźnika hemolitycznego jako podstawy normalizacji surowca z powodu zbyt dużej rozbieżności wyników oznaczenia.
• Wartości wskaźnika pienienia były bardziej wyrównane niż wartości wskaźnika hemolitycznego.

tekst: mgr farm. Dorota Kohl