Kultura korzeni transgenicznych Taxus x media var. Hicksii w pożywce DCR-M

Wpływ warunków hodowli na wytwarzanie wybranych taksanów w kulturze korzeni transgenicznych Taxus x media var. Hicksii


Nowotwory stanowią jedno z największych zagrożeń dla ludzkości – co czwarty mieszkaniec świata umiera na te choroby. W Polsce są one drugą co do liczebności przyczyną zgonów.
Poszukiwanie związków działających przeciwnowotworowo jest priorytetem dla wielu ośrodków naukowych na całym świecie.

Badania zainicjowane w 1962 roku przez Narodowy Instytut Przeciwrakowy w USA zwróciły uwagę na cisy i zaowocowały odkryciem taksolu. Związek ten, obecnie znany jako paklitaksel, po raz pierwszy wyizolowano z kory Taxus brevifolia i wykazano jego działanie toksyczne na linie komórkowe ludzkiego raka pochodzącego z okolicy noso-gardłowej.

Preparaty z paklitakselu
Paklitaksel jest diterpenoidem zawierającym podstawowy szkielet taksanu. Charakteryzuje go obecność pierścienia oksetanowego w pozycji C4, C5 i rozbudowanego łańcucha bocznego w pozycji C13. Elementy te są niezwykle istotne dla jego aktywności biologicznej. Wysoka skuteczność przeciwnowotworowa paklitakselu jest wynikiem unikatowego mechanizmu działania polegającego na przeciwdziałaniu depolimeryzacji mikrotubul.

W leczeniu onkologicznym stosuje się dwa preparaty: Taxol®, wprowadzony na rynek w 1992 r. przez firmę Bristol-Myers Squibb, zawierający jako substancję czynną paklitaksel, oraz Taxotere® zawierający jego syntetyczny analog docetaksel, opatentowany przez francuską firmę Rhône Poulenc-Rorerb.

Izolacja paklitakselu
Droga izolacji paklitakselu, z bardzo wolno rosnących cisów, jest trudna i kosztowna, a wydajność niska. Przeciętna kuracja dla jednego pacjenta wynosi 2 g paklitakselu, co wymaga zniszczenia około 667 okazów. Roczne zapotrzebowanie szacuje się na 200-300 kg tego związku. Każdego roku wzrasta ono 10-krotnie.

Obecnie paklitaksel otrzymuje się drogą półsyntezy z 10-deacetylobakkatyny III (10-DABIII) izolowanej z igieł uprawianych na plantacjach roślin Taxus baccata. Jednakże ilość tego związku pozyskiwana tą drogą wciąż jest niewystarczająca dla rosnących potrzeb.

Aby uchronić naturalne zasoby cisów, zaczęto szukać nowych alternatywnych źródeł pozyskiwania paklitakselu. Najbardziej obiecującym są kultury in vitro tkanek i organów cisów. Koreańska firma Samyang Genex od 2001 roku produkuje lek o nazwie Genexol® zawierający paklitaksel izolowany z kultur zawiesinowych Taxus chinensis. Trwają również badania nad korzeniami transgenicznymi, jako potencjalnymi źródłami pozyskiwania taksanów.

Korzenie transgeniczne
W Katedrze i Zakładzie Biologii i Botaniki Farmaceutycznej AM w Warszawie udało się uzyskać korzenie transformowane Taxus x media var. Hicksii, które posłużyły jako materiał do przeprowadzonych badań. Korzenie transgeniczne charakteryzują się szybkim przyrostem biomasy i utrzymującą się na stałym poziomie syntezą metabolitów wtórnych. Ponadto wykazują zdolność wytwarzania paklitakselu w ilościach porównywalnych lub wyższych niż jego zawartość w organach Taxus brefivolia. Dodatek do pożywek odpowiednich prekursorów i elicytorów stymuluje produkcję metabolitów wtórnych. Obecnym celem badań biotechnologicznych jest taka optymalizacja warunków hodowli in vitro, aby możliwe było pozyskiwanie znacznych ilości taksanów, a tym samym stosowanie hodowli in vitro na skalę przemysłową.

Opis doświadczenia
Niniejsza praca opisuje badanie wpływu warunków hodowli oraz prekursorów (fenyloalanina – FEN, kwas para-aminobenzoesowy – PAB) i elicytora (jasmonianu metylu – JM) na przyrosty biomasy i akumulację taksanów (paklitakselu, bakkatyny III i 10-DABIII) w badanej kulturze korzeni. W doświadczeniu stosowano modyfikowaną pożywkę DCR. Oznaczenia zawartości taksanów wykonano metodą HPLC-UV.

Do badań pobierano próbki z każdego stężenia prekursorów po 48 h oraz po 1, 2, 3 i 4 tygodniach, a dla prekursorów z dodatkiem elicytora – po 2 tygodniach. Oznaczano przyrosty świeżej masy korzeni dla każdej z modyfikacji. W kulturach prowadzonych na świetle obserwowano wyższe przyrosty biomasy zarówno w obecności FEN, jak i PAB we wszystkich zastosowanych stężeniach. Ponadto na świetle zaobserwowano rozwój tkanki kalusowej i zielenienie korzeni, czego nie obserwowano w przypadku kultur prowadzonych w ciemności. Najkorzystniejsze dla wzrostu okazało się stężenie 10 µM obu prekursorów. Po 4 tygodniach uzyskano najwyższe przyrosty 3,51 dla PAB i 2,64 dla FEN.

Uzupełnienie pożywek z prekursorami jasmonianem metylu spowodowało zahamowanie przyrostów świeżej masy korzeni zarówno na świetle, jak i w ciemności. W kolejnym etapie badano zawartość taksanów metodą HPLC-UV. Pod wpływem PBA paklitaksel akumulował się wyłącznie w korzeniach. Najwyższą jego zawartość – 140,31 µg/g s.m. zanotowano pod wpływem stężenia 10 µM PBA po 2 tygodniach kultury w ciemności. Pod wpływem 1 µM PAB, po 3 tygodniach prowadzenia kultury na świetle, uzyskano ponad 3 razy więcej paklitakselu w korzeniach (118,03 µg/g s.m) niż w tych samych warunkach pod wpływem 1 µM FEN (37,06 µg/g s.m.). W przypadku hodowli prowadzonych w pożywkach z FEN była to najwyższa odnotowana zawartość paklitakselu.

Obecność 10-DABIII stwierdzono wyłącznie w podłożach hodowlanych w kulturze prowadzonej w modyfikacji pożywki zawierającej 1 µM PAB. Więcej 10 DABIII akumulowało się w hodowli prowadzonej na świetle (po 48h – 0,25 µM).

Bakkatynę III wykryto zarówno w korzeniach, jak i podłożach hodowlanych. Pod wpływem FEN, w hodowlach na świetle, związek ten akumulował się w korzeniach, a w hodowlach w ciemności – tylko w pożywce. Najwięcej bakkatyny III – 112,73 µg/g s.m. oznaczono w korzeniach rosnących na świetle w obecności 10 µM FEN po 48 h. Jasmonian metylu (100 µM) zastosowany wraz z prekursorami w kolejnych modyfikacjach znacznie zwiększał wydajność paklitakselu. Najwyższą jego zawartość – 485,95 µg/g s.m. stwierdzono w korzeniach rosnących w ciemności na pożywce uzupełnionej 100 µM FEN i 100 µM JM. Jest to wydajność wyższa niż stwierdzona w organach Taxus x media var. Hicksii rosnącego w warunkach naturalnych i ponad trzykrotnie wyższa niż stwierdzono w korze T. brevifolia.

Wyniki są optymistyczne i potwierdzają wysoki potencjał kultur in vitro, które z zastosowaniem odpowiednich technik biotechnologicznych mogą stanowić wydajne źródło pozyskiwania związków biologicznie czynnych na skalę przemysłową.

tekst:
Anna Kokoszka
Praca zajęła II miejsce w Konkursie Studenckich Prac Naukowych podczas I Ogólnopolskiego Kongresu Naukowego Młodej Farmacji – Warszawa 2006


#Na zdjęciu:
Kultura korzeni transgenicznych Taxus x media var. Hicksii w pożywce DCR-M prowadzona w ciemności po 4 tygodniach (kontrola)

POLECANE DLA CIEBIE

START TYPING AND PRESS ENTER TO SEARCH